ISH探針定制服務
◆ 沒有現貨的原位雜交試劑盒(探針)定做,一般需3-4周左右的時間; |
◆ 定制的探針為3’尾端地高辛高效標記的寡核苷酸探針,用于檢測目的基因mRNA(信使RNA); |
◆ 定制試劑盒為100T,每盒約可以滿足100張切片的需要;常規哺乳動物價格為3000元/盒(POD/AP/FITC/CY3系統);非哺乳類價格為3800元/盒(POD/AP/FITC/CY3系統)。 |
其中POD系統(過氧化物酶系統)形成的陽性復合物較穩定,為最常用的顯色系統。 |
◆ 正式定貨時,用戶需交納定金:500元/盒(注明所訂試劑盒的中英文名稱、實驗動物種類及所用標本)。余款在試劑盒生產完成和檢驗后付清。 |
如果您有定制原位雜交試劑盒的意向,請您下載以下原位雜交定制咨詢卡,填寫后將其發送至我們的郵箱boster@boster.com.cn,以便我們更好地為您確定是否可以正常定做。
試劑盒的使用同原位雜交試劑盒使用方法,原位雜交試劑盒使用實例:BCL-2 原位雜交檢測試劑盒
產品貨號:MK1050
保存條件:置4℃。
工作量:100張切片。
有效期:一年。
BCL-2 是主要的抗凋亡基因。本試劑盒采用針對人、大鼠、小鼠的BCL-2 特異性的寡核苷酸探針,經地高辛標記。由于采用多相寡核苷酸探針和高敏感標記技術,并配合使用敏感性加強型的原位檢測方法,具有敏感性特別高,背景清晰,結果準確可靠的優點??梢詸z測出常規福爾馬林固定,石蠟包埋標本的BCL-2 mRNA 序列。針對大鼠、小鼠BCL-2 靶基因的mRNA 序列為:
(1) 5’——GATGA AGTAC ATCCA TTATA AGCTG TCACA——3’;
(2) 5’——GCGCT CAGCC CTGTG CCACC TGTGG TCCAC——3’;
(3) 5’——GGGAG ATGTC ACCCC TGGTG GACAA CATCG——3’;
大鼠、小鼠和人的序列僅3bp/90bp 不同,兔和人序列基本相同。
適用種屬:人、大鼠、兔、小鼠組織。
試劑盒中內容
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml;
2. 預雜交液2ml;
3. Bcl-2寡核苷酸探針雜交液2ml;
4.封閉液5ml;
5.生物素化鼠抗地高辛5ml;
6. SABC-POD 5ml;
7. 生物素化過氧化物酶5ml。
用戶自備試劑:原位雜交專用蓋玻片(博士德有售);POLY-L-LYSINE;DEPC;20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC,0.5×SSC,0.2×SSC, 原位雜交用PBS )
一.培養細胞和冰凍切片
準備工作:
固定液:4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6);1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7·H2O)3g,PH2.0左右。2×SSC——1000ml 蒸餾水中加氯化鈉17.6g,檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3·2H2O,分子量294)8.8g。0.5×SSC——300ml 蒸餾水加100ml 2×SSC 即可。0.2×SSC——270ml 蒸餾水加30ml 2×SSC 即可。20%甘油——20ml 甘油加80ml 蒸餾水即可。原位雜交用PBS——0.02M phosphate ;0.5M NaCl(1000ml 蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4·12H2O6g, NaH2PO4·2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序: 注意:最重要的是及時固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC 處理,以抑制RNA 酶對mRNA 的分解作用。此外,過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1.玻片的處理:一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養,條件為37℃和5%的CO2,所用培養基為
Dulbecco 基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2 分鐘×3 次。
3.培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定:固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室溫固定20--30 分鐘。蒸餾水充分洗滌,干燥后-20℃冰凍可保存2 周以
上。
4.30%H2O2 1 份+純甲醇50 份混合,室溫處理30 分鐘。蒸餾水洗滌3 次。
5.暴露mRNA 核酸片段:切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2 滴濃縮型胃蛋白酶,混勻),37℃或室溫消化5—120 秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用PBS 洗3 次×5 分鐘。蒸餾水洗1 次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000DEPC。室溫固定10 分鐘。蒸餾水洗滌3 次。
7. 預雜交:濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml 以保持濕度。按每張切片20μι
加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4 小時。吸取多余液體,不洗。
8. 雜交——按每張切片20μι雜交液,加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后,
蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。
9. 雜交后洗滌:揭掉蓋玻片,37℃左右水溫的2×SSC 洗滌5 分鐘×2 次;37℃0.5×SSC 洗滌15 分鐘×1 次; 37℃0.2×SSC 洗滌15 分鐘×1 次(如果有非特異性染色,重復0.2×SSC 洗滌15 分鐘×1-2 次)。
10.滴加封閉液:37℃30 分鐘。甩去多余液體,不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高辛:37℃ 60 分鐘或室溫120 分鐘。原位雜交用PBS 洗5 分鐘×4 次。
勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC:37℃20 分鐘或室溫30 分鐘。原位雜交用PBS 洗5 分鐘×3 次。勿用其它緩沖液
和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶:37℃20 分鐘或室溫30 分鐘。原位雜交用PBS 洗5 分鐘×4 次。
14.DAB 顯色:使用DAB 顯色試劑盒—1ml 蒸餾水加顯色劑A,B,C 各一滴,混勻,加至標本上。一般顯色20-30 分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB 顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復染,充分水洗。
16.酒精脫水,二甲苯透明,封片。
二.石蠟切片
如果有條件的話,應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后,及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6),含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm 的小塊,固定1 小時即可,較大的標本固定不要超過2 小時。某些組織對過度固定尤其敏感,如動物大腦,固定時間30-40 分鐘,一般不要超過1 小時。
1. 常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2. 玻片的處理:一般采用多聚賴氨酸或APES。
3. 石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O2 1 份+蒸餾水10 份混合,室溫5-10 分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3 次。
4.暴露mRNA 核酸片段:切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2 滴濃縮型胃蛋白酶,混勻),37℃或室溫消化3--30 分鐘(視標本新舊、厚薄自行調整)。用戶可以比較不同的消化時間,例如5 分鐘,10 分鐘,20 分鐘,30 分鐘。以找到最佳的消化時間。原位雜交用PBS 洗3 次×5 分鐘。蒸餾水洗1 次。其余步驟和冰凍切片6-16 步相同。
結果觀察:bcl-2 mRNA 的細胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項:由于特定的mRNA 序列僅占總mRNA 的極少數,加上基因僅由四個堿基排列組合而成,因此原位雜交容易出現非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照,基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現象時,用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋,一般稀釋2—10 倍;并應加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況;如果出現大量的細胞核著色,往往和標本固定時間過長有關,應重新處理標本。