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Instructions

試劑盒的使用同原位雜交試劑盒使用方法，原位雜交試劑盒使用實例：BCL-2 原位雜交檢測試劑盒

產品貨號：MK1050

保存條件：置４℃。

工作量：100張切片。

有效期：一年。

       BCL-2 是主要的抗凋亡基因。本試劑盒采用針對人、大鼠、小鼠的BCL-2 特異性的寡核苷酸探針，經地高辛標記。由于采用多相寡核苷酸探針和高敏感標記技術，并配合使用敏感性加強型的原位檢測方法，具有敏感性特別高，背景清晰，結果準確可靠的優點?？梢詸z測出常規福爾馬林固定，石蠟包埋標本的BCL-2 mRNA 序列。針對大鼠、小鼠BCL-2 靶基因的mRNA 序列為：

（1） 5’——GATGA AGTAC ATCCA TTATA AGCTG TCACA——3’；

（2） 5’——GCGCT CAGCC CTGTG CCACC TGTGG TCCAC——3’；

（3） 5’——GGGAG ATGTC ACCCC TGGTG GACAA CATCG——3’；

大鼠、小鼠和人的序列僅3bp/90bp 不同，兔和人序列基本相同。

適用種屬：人、大鼠、兔、小鼠組織。

試劑盒中內容

1.胃蛋白酶（×10; Pepsin）2ml；

2. 預雜交液2ml；

3. Bcl-2寡核苷酸探針雜交液2ml；

4.封閉液5ml;

5.生物素化鼠抗地高辛5ml;

6. SABC-POD 5ml；

7. 生物素化過氧化物酶5ml。

用戶自備試劑：原位雜交專用蓋玻片（博士德有售）；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油

緩沖液（3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC， 原位雜交用PBS ）

一．培養細胞和冰凍切片

準備工作：

固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6）；1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6）3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸（C6H8O7·H2O）3g,PH2.0左右。2×SSC——1000ml 蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉（C6H5O7Na3·2H2O，分子量294）8.8g。0.5×SSC——300ml 蒸餾水加100ml 2×SSC 即可。0.2×SSC——270ml 蒸餾水加30ml 2×SSC 即可。20%甘油——20ml 甘油加80ml 蒸餾水即可。原位雜交用PBS——0.02M phosphate ；0.5M NaCl(1000ml 蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4·12H2O6g, NaH2PO4·2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。

操作程序： 注意：最重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC 處理，以抑制RNA 酶對mRNA 的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。

1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。

2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和5%的CO2，所用培養基為

Dulbecco 基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2 分鐘×3 次。

3．培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室溫固定20--30 分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2 周以

上。

4．30%H2O2 1 份+純甲醇50 份混合，室溫處理30 分鐘。蒸餾水洗滌3 次。

5．暴露mRNA 核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml 3% 檸檬酸加2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化5—120 秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用PBS 洗3 次×5 分鐘。蒸餾水洗1 次。

6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000DEPC。室溫固定10 分鐘。蒸餾水洗滌3 次。

7. 預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml 以保持濕度。按每張切片20μι

加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4 小時。吸取多余液體，不洗。

8. 雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，

蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。

9. 雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC 洗滌5 分鐘×2 次；37℃0.5×SSC 洗滌15 分鐘×1 次; 37℃0.2×SSC 洗滌15 分鐘×1 次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC 洗滌15 分鐘×1-2 次)。

10.滴加封閉液：37℃30 分鐘。甩去多余液體，不洗

11.滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60 分鐘或室溫120 分鐘。原位雜交用PBS 洗5 分鐘×4 次。

勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

12.滴加SABC：37℃20 分鐘或室溫30 分鐘。原位雜交用PBS 洗5 分鐘×3 次。勿用其它緩沖液

和蒸餾水洗滌。

13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20 分鐘或室溫30 分鐘。原位雜交用PBS 洗5 分鐘×4 次。

14.DAB 顯色：使用DAB 顯色試劑盒—1ml 蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C 各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30 分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB 顯色劑后顯色。充分水洗。

15.必要時蘇木素復染，充分水洗。

16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。

二．石蠟切片

如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm 的小塊，固定1 小時即可，較大的標本固定不要超過2 小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40 分鐘，一般不要超過1 小時。

1． 常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。

2． 玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。

3． 石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O2 1 份+蒸餾水10 份混合,室溫5-10 分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3 次。

4．暴露mRNA 核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml 3% 檸檬酸加2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化3--30 分鐘（視標本新舊、厚薄自行調整）。用戶可以比較不同的消化時間，例如5 分鐘,10 分鐘，20 分鐘，30 分鐘。以找到最佳的消化時間。原位雜交用PBS 洗3 次×5 分鐘。蒸餾水洗1 次。其余步驟和冰凍切片6-16 步相同。

結果觀察：bcl-2 mRNA 的細胞胞漿著色呈棕黃色。

注意事項：由于特定的mRNA 序列僅占總mRNA 的極少數，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現象時，用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10 倍；并應加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關，應重新處理標本。

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